养殖鱼类种质检验 第12部分：染色体组型分析
2006-11-21 00:00:00   来源：   点击：

中华人民共和国国家标准



1 范围
   GB/T18654的本部分规定了鱼类染色体组分析的试剂和材料、仪器和设备、玻片标本的制备和组型分析。
   本部分适用于鱼类染色体组型分析，对于水产养殖中的其他水生动物亦可参照执行。
2 规范性引用文件
  下列文件中的条款通过GB/T18654的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单或修改版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。
   GB/T18654.2 养殖鱼类种质检验  第2部分：抽样方法
3 术语和定义
  下列术语和定义适用于GB/T18654的部分。
3.1 
  体细胞外培养法
  通过无菌操作，获取的肾脏组织或血细胞，在体外培养过程中，加入细胞分裂刺激物，刺激淋巴细胞大量进入分裂状态。然后，加入适量浓度的秋水仙素，使细胞分裂被阻抑在分裂中期，而获得鱼类细胞染色体中期分裂组。
3.3 
   体细胞直接法
   将小鱼浸泡在适当浓度的秋水仙素溶液中，使其分裂旺盛的鳃丝上皮细胞被阻抑在分裂中期，而获得鱼类细胞染色体中期分裂相。
3.4
   胚胎细胞直接法
   选用发育正常的囊胚期或原肠期早期胚胎，将其细胞吹打分散后，加入适当浓度的秋水仙素 ，阻抑在分裂中期，获得鱼类染色体中期分裂组相。
3.5


空气干燥法
将收集的细胞经过低渗、固定、滴片，然后斜放静置，待其自然干燥。
3.6
   火焰干燥法
   将收集的细胞经过低渗、固定、滴片，然后立即将玻片置于酒精灯的火焰上均匀烘烤，或直接将玻片置于火焰上滴片。
3.7
  臂比
  染色体的长臂长度与短臂长度之比。
3.8
  相对长度
  每条染色体长度与单倍体组染色体总长度之比，以百分值或千分值表示。
4 方法提要
  使用细胞分裂刺激物刺激鱼类淋巴细胞分裂，或者直接收集分裂旺盛鳃丝上皮细胞、胚胎细胞。然后利用秋水仙素破坏纺锤丝阻抑在分裂中期，再经过低渗、固定、滴片和染色，最后进行镜检分析。
5 试剂和材料
5.1 肝素溶液：浓度为500IU/ML
5.2 小牛或胎牛血清。
5.3 青霉素、链霉素和卡那霉素。
5.4 培养基：TC—199、RPMI—1640或EAGLESMEM。
 培养液配制方法：上述培养基80%加20%小牛或胎牛血清，每毫升培养液含青霉素、链霉素、卡那霉素分别为100IU、100MG、50IU，用碳酸氢钠溶液调至PH7.2。
5.5 植物血球您凝集素（PHA）溶液，根据厂家推荐剂量使用。
5.6 生理盐水：0.75%氯化钠溶液。
5.7 秋水仙素溶液：浓度为20UG/ML~40UG/ML。
5.8 甲醇。
5.9 冰乙酸。
5.10 固定液：3份甲醇加1份冰乙酸，现用现配。
5.11 低渗溶液：0.0375MOL/L 氯化钾溶液。5.12 吉姆萨原液：称0.5GGIEMSA粉，甘油33ML，在研钵内用少量甘油与GIEMSA粉混合，研磨至无颗粒，再将剩余甘油倒入，在56度条件下保温2小时后，加入33ML甲醇，保存于棕色瓶内。
5.13 磷酸缓冲液（PBS）：浓度为0.2MOL/L

6 仪器和设备
6.1 无菌室。
6.2 超净工作台。
6.3 恒温培养箱或二氧化碳培养箱。
6.4 离心机。
6.5 天平（感量0.00001G）
6.6 显微镜（带显微摄影）
6.7 照相机
6.8 整套暗室设备。
6.9 游标卡尺（精度0.01MM）
6.10 温控电热板
6.11 解剖工具一套
6.12 注射器针头
6.13 可调移液器10UL~200UL。
6.14细口吸管、吸管5ML~10ML离心管、冰冻及干热载玻片。
6.15 25ML培养瓶或青、链霉素小瓶，瓶塞等。
7 玻片标本的制备
7.1 抽样
   样品鱼的抽样按GB/T1865402的规定执行。
7.2 体细胞体外培养法
   体细胞体外培养法常采用肾组织细胞培养和血细胞培养，本部分仅规定了肾组织细胞培养的操作步骤，细胞培养的操作步骤见附录A。
7.2.1 将式样鱼鳃血管剪断，尽量放血。刮去鱼体一侧的鳞片，尤其是解剖部位需刮干净。
7.2.1 把鱼放在超净工作台上或无菌室里，铺上消毒纱布，用碘酒和酒精棉求依次消毒已去鳞的部位。
7.2.3 吸取3ML~5ML培养液置于青霉素瓶中。
7.2.4 用解剖刀沿脊椎下方切开适当长度，用解剖剪将肋骨剪断，露出肾脏。
7.2.5 用镊子夹取适量肾组织，放入盛有培养液的青霉素瓶中，将组织块用镊子撕碎，轻轻搅动，然后静置三分钟到五分钟，待未撕碎的组织块沉淀。用刻度吸管吸取上部细胞悬液，移入培养瓶中，再加入适量的培养液，使每瓶为4ML或5ML细胞的密度可根据目测浊度进行粗略调整，或用血球计数板计数后确定，一般为（5~10）*10E个/ML。
7.2.6 用注射器滴加PHA，一般为5ML培养液加0.1ML~0.2ML。盖上胶塞，轻轻摇匀。
7.2.7 将以种的培养瓶放在恒温培养箱或二氧化碳培养箱内。培养温度一般为18到28度，时间1D~5D。期间，细胞一般分裂1~4次。可根据具体情况选用合适的培养温度和时间。每天需将培养瓶轻轻摇动1~2次。
7.2.8收集细胞：在收集细胞前1。5H~4H，用可调移液器加入秋水仙素溶液，使其倒入离心管，再用少数生理盐水将培养瓶内残留细胞洗出，再倒进离心管。
7.2.9 低渗：将收集有细胞的离心管以700R/MIN~1000R/MIN离心5MIN。然后轻轻吸除上清液，约留0.5ML~1ML现配固定溶液，吹打均匀，以700R/MIN~1000R/MIN离心5分钟。
7.2.10 固定：先吸除上清液，加入少许固定液，吹打均匀，再加入2ML~3ML固定液，静置20分钟，按


7.2.9 规定离心。再重复规定，必要时可重复固定三次。
7.2.11 滴片：吸除上清液，加适量现配固定液，将细胞吹打均匀。吸取细胞悬液
在45度倾斜的冰冻玻片上滴2~3滴，并轻轻吹动，使细胞铺散开。然后将铺散细胞
的玻片斜放静置，待其自然干燥，此为空气干燥法。有时为使染色体分散更好，可采用火焰干燥法。
7.2.12 染色：用磷酸盐缓冲液（PH=7.2）将GIEMSA原液按9：1稀释，配成工作液
（用时配）。取一块干净的玻璃，以略小于玻片长度为间距放置干净玻片作架，将待染的玻片置于染色的容器内，将染液加入，染色10MIN~20MIN后取出，用自来水冲去染液，干燥后即可用于观察分析。
7.3 体细胞体内培养法
7.3.1 往样品鱼腹腔注射PHA溶液，剂量按厂家推荐剂量使用。然后继续饲养6~120H。
7.3.2 处死鱼前2~6H，按1UL/G鱼体腹腔注射秋水仙素溶液。将腮丝血管剪断，尽量放血，取出肾脏组织，放入盛有3ML~5ML生理盐水的青霉素瓶中。将组织块撕碎，用镊子轻轻搅动后静置3MIN~5MIN，待未碎的组织块沉淀，用吸管吸取细胞悬液，加入离心管中。
   或者不注射秋水仙素，而是先将肾组织取出，撕碎，放入盛有培养液的青霉素瓶中，加入秋水仙素溶液，终浓度为0.1UL/ML~0.5UL/ML培养液，于25度静置2H~3J。然后用镊子轻轻震荡，待稍沉淀后，用吸管吸出上层细胞悬液，加入离心管中。
7.3.3 低渗、固定、滴片、染色分别按7.2.9~7.2.12的规定执行。
7.4 体细胞直接法
  此法适用于难以取肾的小鱼。
7.4.1 将式样鱼放入含有0.1%秋水仙素溶液的容器中浸泡6小时左右。
7.4.2 放血杀鱼，小心把鳃片剪下，将腮丝放入甲醇：冰乙酸为9：1的固定溶液中浸泡处理7MIN~10MIN，再转入100%的冰乙酸中浸泡处理1MIN！2MIN。
7.4.4 卡诺氏固定溶液2~3次，每次一小时，最后一次可放在常温或冰箱中1小时到十五小时。
7.4.5 滴片前，将固定过的腮丝放入50%的冰乙酸中，用镊子夹注腮丝轻轻震动，是细胞从腮丝上脱落，丢弃鳃弓鳃丝，液体则为细胞悬液。
7.4.6 将细胞悬液滴到控温电热板上50度至60度的干净玻片上，5分钟后吸弃多余液体。
7.4.7 染色按7.2.12的规定执行。
7.5 胚胎细胞直接
7.5.1 用大口径吸管挑选发育正常的胚囊期或原肠期早期胚胎。
7.5.2 孵性卵，则用口径稍大于胚胎的小口吸管吸破卵膜，再将胚胎细胞吸入离心管中。粘性卵，则用铲形镊子将卵膜挤破，用吸管将胚胎细胞吸入离心管中。
7.5.3 用吸管把胚胎细胞吹打散开，补加生理盐水至4ML~5ML，再加入秋水仙素溶液，终浓度为10UL/50UL，静置15MIN~60MIN。
7.5.4 低渗按7.2.9规定进行。
7.5.5 固定、滴片、染色分别按7.2.10~7.2.12规定执行。
8 组型分析
8.1 染色体数的确定
   在油镜下选取50~100个分散良好，形态清晰，数目完整的分裂组，计数每个分裂相的染色体数目，找出染色体数目的众数，并计算众数所占百分比，拒此确定鱼的染色体数。
8.2 染色体分组和臂数的计算
8.2.1 鱼类染色体分组一般按臂比将染色体分为四组：
A）中部着丝粒染色体M组，臂比为1.00~1.70；


B）亚中部着丝粒染色体SM组，臂比为1.71~3.00； C）亚端部着丝粒染色体ST组，臂比为3.01~70..； D）端部着丝粒染色体T组，臂比为7.00~无穷 8.2.2 染色体臂数（NF）的计数：中部和亚中部着丝粒的臂数计为2，亚端部着丝粒染色体的臂数计为1。 8.3 染色体分组方法
   在油镜下选取10~15个数目完整，分散良好，长度适中（正中期），着丝粒清楚，两条染色单体适度分开，形态清晰的分裂相进行显微摄影。显微摄影的有关事项参见附录B。在照片上用游标卡尺测量每条染色体的长臂和短臂长度，按8.2.1的规定将染色体分组，并按8.2.2的规定确定染色体的臂数得出核型公式然后计算得出核型指数，包括臂比和相对长度，大小配对，并按M、SM、ST和T组顺序排列，每组内染色体按相对长度从大到小排列、贴好，然后翻拍。 8.4 核型公式
   根据十个以上的中期分裂染色体测量分组等分析的结果，就可确定该种鱼类的染色体数目，染色体分组情况，染色体臂数和染色体的相对长度。表示这一结果的表达式称为核型公式。
  示例：某鱼的核型公式为2N=48，26M+14SM+8ST，NF=88。 8.5 其他形态特征的观察
   除计数和分组外还需要观察染色体的其他形态特征，如有无异性染色体对，次缢痕，随体等，并计入结果。
 


中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局
2002—02—19批准    
2002—05—01实施