鸡马立克氏病诊断技术标准
2006-11-21 00:00:00   来源：   点击：

中华人民共和国国家标准

GB／T 18643—2002
Diagnotic techniques for Marek's disease
1  范围
    本标准规定了鸡马立克氏病(MD)的诊断技术。
    本标准适用于MD的流行学病普查、产地和口岸检疫、SPF鸡群的疫病监测。
2  MD琼脂扩散试验检测技术
    鸡马立克氏病琼脂扩散试验既可以用于马立克氏病病毒抗原的检出，也可以用于马立克氏病病毒抗体的检出。该方法一般在马立克氏病病毒感染14d～24d后检出病毒抗原；抗体的检出一般在病毒感染3周后。
2．1  材料准备
2．1．1  抗原和标准阳性血清。
2．1．2  溶液配制：
    a)pH7．4 0．01 mol／L磷酸盐缓冲液；
    b)1％硫柳汞溶液；
    c)生理盐水。
    以上各种溶液配制方法见附录A(标准的附录)。
2．1．3  琼脂板的制备：见附录B(标准的附录)。
2．2  操作方法
2．2．1  马立克氏病病毒抗原检测
2．2．1．1  打孔
2．2．1．1．1  在已制备的琼脂板(见附录B)上，用直径4mm或3mm直径的打孔器按六角形图案打孔，或用梅花形打孔器打孔。中心孔与外周孔距离为3mm。
2．2．1．1．2  将孔中的琼脂用8号针头斜面向上从右侧边缘插入，轻轻向左侧方向挑出，勿损坏孔的边缘，避免琼脂层脱离子皿底部。
2．2．1．2  封底
    用酒精灯火焰轻烤平皿底部至琼脂轻微溶化为止，封闭孔的底部，以防样品溶液侧漏。
2．2．1．3  加样
    用微量移液器吸取用灭菌生理盐水稀释的标准阳性血清(按产品使用说明书的要求稀释)滴人中央孔，标准阳性抗原悬液分别加入外周的第1、第4孑L中，在外周的第2、3、5、6孔处(不打孔)按顺序分别插入被检鸡的羽毛髓质端(长度约0．5cm)；或在第2、3、5、6孔中加入被检的羽髓浸出液，每孔均以加满不溢出为度，每加一个样品应换一个吸头。
2．2．1．4  感作
    加样完毕后，静止5 rain～10rain，将平皿轻轻倒置，放人湿盒内，置37℃温箱中反应，分别在24h和48h观察结果。
2．2．2  马立克氏病抗体检测
    操作方法同2．2．1，加样如下：用微量移液器吸取用灭菌生理盐水(见附录A中A3)稀释的标准抗原液(按产品使用说明书的要求稀释)滴人中央孔，标准阳性血清分别加入外周的第1、第4孔中，待检血清按顺序分别加入外周的第2、3、5、6孔中。每孔均以加满不溢出为度，每加一个样品应换一个吸头。
2．3  结果判定及判定标准
    MD琼脂扩散试验结果判定如图1所示
2．3．1  将琼脂板置日光灯或侧强光下进行观察，当标准阳性血清与标准抗原孔间有明显沉淀线，而待检血清与标准抗原孔间或待检抗原与标准阳性血清孔之间有明显沉淀线，且此沉淀线与标准抗原和标准血清孔间的沉淀线末端相融合，则待检样品为阳性。
2．3．2  当标准阳性血清与标准抗原孔的沉淀线的末端在比邻的待检血清孔或侍检抗原孔处的末端向中央孔方向弯曲时，待检样品为弱阳性。
2．3．3  当标准阳性血清与标准抗原孔间有明显沉淀线，而待检血清与标准抗原孔或待检抗原与标准阳性血清孔之间无沉淀线，或标准阳性血清与抗原孔间的沉淀线末端向毗邻的待检血清孔或待检抗原孔直伸或向外侧偏弯曲时，该待检血清为阴性。
2．3．4  介于阴、阳性之间为可疑。可疑应重检，仍为可疑判为阳性。
3  MD的临床诊断与判定标准
3．1  MD的特征性临床症状
    在鸡群中，病鸡临床症状表现为瘫痪，并且两腿前后伸展呈“劈叉”姿势时，一般可以作为MD的示病症状，可初步判定为MD。
3．2  MD的特征性病理变化
3．2．1  MD的神经特征性病理变化
    神经型MD的病理变化为外周神经肿胀，呈半透明水肿样，色泽变淡，横纹消失，其肿胀程度一般为正常神经的2～3倍。这些变化多发生在腰荐神经丛、坐骨神经丛、臂神经丛、颈部迷走神经丛等部位。由于多为不对称性，通过比较对侧神经将有助于判定。
3．2．2  MD的皮肤特征性病理变化
    皮肤型MD病理变化比较少见。其病理变化特征为：以皮肤的羽毛囊为中心，形成半球形隆起的肿瘤，其表面有时可见鳞片状棕色痂皮。
3．2．3  MD的眼睛特征性病理变化
    眼型MD是由于淋巴细胞浸润虹膜而导致的病理变化，虹膜呈环状或斑点状褪色，出现淡灰色；瞳孔不规则，有时偏向虹膜一侧。
3．3  MD的病理组织学变化
    采集病鸡肿胀的外周神经和内脏的肿瘤组织样品，按常规方法制备石蜡切片、苏木素伊红(HE)染色。通过普通光学显微镜进行病理组织学观察判定。
    根据病变组织中浸润细胞的种类及形态学，外周神经病理组织学变化可分为A、B、C三个型。在同一只鸡的不同神经可能会出现不同的病变型。A型病变以淋巴母细胞，大、中、小淋巴细胞及巨噬细胞的增生浸润为主。B型病变表现神经水肿，神经纤维被水肿液分离，水肿液中以小淋巴细胞、浆细胞和许旺氏细胞增生为主。C型病变为轻微的水肿和轻度小淋巴细胞增生。
    内脏和其他组织的肿瘤与A型神经病变相似。通常为大小各异的淋巴细胞增生为主。
3．4  鉴别诊断
    禽白血病(LL)和网状内皮增生病(RE)是两种主要的在病理剖检中容易与缺乏外周神经病变的内脏型MD相混淆的传染病。一般需要通过流行病学和病理组织学进行鉴别诊断。
3．4．1  与LL鉴别诊断
    在流行病学方面，LL一般发生于16周龄以上的鸡，并多发生于24～40周龄之间。而MD的死亡高峰一般发生在10～20周龄之间。另外，LL的发病率较低，一般不超过5％，而MD的发病率较高。
    LL肿瘤病理组织学变化主要表现为大小均一的淋巴母细胞增生浸润。另外，在LL与MD引起的法氏囊肿瘤中，其肿瘤细胞的浸润部位存在着差异。MD肿瘤细胞主要在滤泡间增殖，而LL肿瘤细胞则主要在滤泡内增殖。
3．4．2  与RE鉴别诊断
    尽管RE在不同的鸡群中感染率差异较大，但一般发病率较低。本病的病理组织学特点为：未分化的大型肿瘤细胞增殖，肿瘤细胞具有丰富的嗜碱性细胞质、核大而淡染，核内有较大的嗜碱性核仁，肿瘤细胞多见有丝分裂像。


中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局2002—02—19批准    
2002—05—01实施